Interferensfaktorer i PCR-reaktioner

Under PCR-reaktionen påträffas ofta vissa störande faktorer.
På grund av den mycket höga känsligheten hos PCR anses kontaminering vara en av de viktigaste faktorerna som påverkar PCR-resultaten och kan ge falskt positiva resultat.
Lika kritiska är de olika källorna som leder till falskt negativa resultat. Om en eller flera väsentliga delar av PCR-blandningen eller själva amplifieringsreaktionen hämmas eller störs, kan den diagnostiska analysen hindras. Detta kan leda till minskad effektivitet och till och med falskt negativa resultat.
Förutom hämning kan förlust av målnukleinsyraintegritet inträffa på grund av transport- och/eller lagringsförhållanden före provberedningen. I synnerhet kan höga temperaturer eller otillräcklig lagring leda till skador på celler och nukleinsyror. Cell- och vävnadsfixering och paraffininbäddning är välkända orsaker till DNA-fragmentering och ett ihållande problem (se figur 1 och 2). I dessa fall hjälper inte ens optimal isolering och rening.

Figur 1 | Effekt av immobilisering på DNA-integritet
Agarosgelelektrofores visade att kvaliteten på DNA som isolerats från paraffinsnitt av obduktioner varierade avsevärt. DNA av olika genomsnittliga fragmentlängder fanns närvarande i extrakten beroende på fixeringsmetoden. DNA bevarades endast när det fixerades i naturliga frysta prover och i buffrat neutralt formalin. Användningen av ett starkt surt Bouin-fixativ eller obuffrat, myrsyrainnehållande formalin resulterade i en betydande förlust av DNA. Den återstående fraktionen är mycket fragmenterad.
Till vänster är längden på fragment uttryckt i kilobaspar (kbp)

Figur 2 | Förlust av integritet för nukleinsyramål
(a) Ett 3′-5′ gap på båda strängarna kommer att resultera i ett brott i mål-DNA. syntes av DNA kommer fortfarande att ske på det lilla fragmentet. Men om ett primer-annealingsställe saknas på DNA-fragmentet sker endast linjär amplifiering. I det mest gynnsamma fallet kan fragmenten återmätta varandra, men utbytena kommer att vara små och under detektionsnivåer.
(b) Förlust av baser, främst på grund av depurinering och tymidindimerbildning, leder till en minskning av antalet H-bindningar och en minskning av Tm. Under den förlängda uppvärmningsfasen kommer primrarna att smälta bort från matris-DNA och kommer inte att hybridisera även under mindre stringenta förhållanden.
(c) Intilliggande tyminbaser bildar en TT-dimer.
Ett annat vanligt problem som ofta uppstår inom molekylär diagnostik är den mindre än optimala frisättningen av målnukleinsyror jämfört med fenol-kloroformextraktion. I extrema fall kan detta förknippas med falska negativa resultat. Mycket tid kan sparas genom kokande lys eller enzymatisk nedbrytning av cellrester, men denna metod resulterar ofta i låg PCR-känslighet på grund av otillräcklig frisättning av nukleinsyra.

Hämning av polymerasaktivitet under amplifiering

I allmänhet används hämning som ett containerkoncept för att beskriva alla faktorer som leder till suboptimala PCR-resultat. I en strikt biokemisk mening är inhibering begränsad till enzymets aktivitet, dvs den minskar eller förhindrar omvandling av substrat-produkt genom interaktion med det aktiva stället för DNA-polymeraset eller dess kofaktor (t.ex. Mg2+ för Taq DNA-polymeras).
Komponenter i provet eller olika buffertar och extrakt som innehåller reagens kan direkt hämma enzymet eller fånga dess kofaktorer (t.ex. EDTA), och därigenom inaktivera polymeraset och i sin tur leda till minskade eller falskt negativa PCR-resultat.
Men många interaktioner mellan reaktionskomponenter och målinnehållande nukleinsyror betecknas också som "PCR-hämmare". När väl cellens integritet störs av isolering och nukleinsyran frisätts, kan interaktioner mellan provet och dess omgivande lösning och fast fas inträffa. Till exempel kan "rensare" binda enkel- eller dubbelsträngat DNA genom icke-kovalenta interaktioner och störa isolering och rening genom att minska antalet mål som så småningom når PCR-reaktionskärlet.
I allmänhet finns PCR-hämmare i de flesta kroppsvätskor och reagenser som används för kliniska diagnostiska tester (urea i urin, hemoglobin och heparin i blod), kosttillskott (organiska komponenter, glykogen, fett, Ca2+-joner) och komponenter i miljön (fenoler). , tungmetaller)

Mer utbredda PCR-hämmare kan hittas i bakterier och eukaryota celler, icke-mål-DNA, DNA-bindande makromolekyler av vävnadsmatriser och laboratorieutrustning som handskar och plast. Rening av nukleinsyror under eller efter extraktion är den föredragna metoden för att avlägsna PCR-hämmare.
Idag kan olika automatiserade extraktionsutrustningar ersätta många manuella protokoll, men 100 % återvinning och/eller rening av mål har aldrig uppnåtts. Potentiella inhibitorer kan fortfarande finnas i de renade nukleinsyrorna eller kan redan ha trätt i kraft. Det finns olika strategier för att minska effekten av inhibitorer. Valet av lämpligt polymeras kan ha en betydande inverkan på inhibitoraktiviteten. Andra beprövade metoder för att reducera PCR-hämning är att öka polymeraskoncentrationen eller använda tillsatser som BSA.
Hämning av PCR-reaktioner kan påvisas genom användning av intern processkvalitetskontroll (IPC).
Försiktighet måste iakttas för att avlägsna alla reagenser och andra lösningar i extraktionssatsen, såsom etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol och fenol, från nukleinsyraisolatet genom ett noggrant tvättsteg. Beroende på deras koncentration kan de aktivera eller hämma PCR.