Störningsfaktorer i PCR -reaktioner

Under PCR -reaktionen uppstår ofta vissa störande faktorer.
På grund av den mycket höga känsligheten för PCR anses kontaminering vara en av de viktigaste faktorerna som påverkar PCR -resultat och kan ge falska positiva resultat.
Lika kritiska är de olika källorna som leder till falska negativa resultat. Om en eller flera väsentliga delar av PCR -blandningen eller själva amplifieringsreaktionen hämmas eller störs, kan diagnostisk analys hindras. Detta kan leda till minskad effektivitet och till och med falska negativa resultat.
Förutom hämning kan förlust av mål nukleinsyras integritet uppstå på grund av frakt och/eller lagringsförhållanden före provberedning. I synnerhet kan höga temperaturer eller otillräcklig lagring leda till skador på celler och nukleinsyror. Cell- och vävnadsfixering och inbäddning av paraffin är välkända orsaker till DNA -fragmentering och ett ihållande problem (se figur 1 och 2). I dessa fall hjälper till och med optimal isolering och rening inte.

Bild 1 | Effekt av immobilisering på DNA -integritet
Agarosgelelektrofores visade att kvaliteten på DNA som isolerades från paraffinsektioner av obduktioner varierade avsevärt. DNA med olika genomsnittliga fragmentlängder var närvarande i extrakten beroende på fixeringsmetoden. DNA bevarades endast när det fixerades i nativa frysta prover och i buffrat neutralt formalin. Användningen av ett starkt surt bouin-fixativ eller obuffrad, myrsyrainnehållande formalin resulterade i en signifikant förlust av DNA. Den återstående fraktionen är mycket fragmenterad.
Till vänster uttrycks fragmentens längd i kilobaspar (KBP)

Bild 2 | Förlust av integritet av nukleinsyramål
(A) Ett 3'-5 ′ -gap på båda strängarna kommer att resultera i en paus i mål-DNA. Syntes av DNA kommer fortfarande att ske på det lilla fragmentet. Men om ett primer -glödgningsställe saknas på DNA -fragmentet inträffar endast linjär amplifiering. I det mest gynnsamma fallet kan fragmenten återupptas varandra, men utbytena kommer att vara små och under detekteringsnivåerna.
(B) Förlust av baser, främst på grund av depurination och bildning av tymiddimer, leder till en minskning av antalet H-bindningar och en minskning av TM. Under den långsträckta uppvärmningsfasen smälter primrarna bort från matris -DNA och kommer inte att glödgas ens under mindre stränga förhållanden.
(c) Intilliggande tyminbaser bildar en TT -dimer.
Ett annat vanligt problem som ofta förekommer i molekylär diagnostik är den mindre än optimala frisättningen av målnukleinsyror jämfört med fenolkloroform extraktion. I extrema fall kan detta förknippas med falska negativa. Mycket tid kan sparas genom kokande lys eller enzymatisk matsmältning av cellskräp, men denna metod resulterar ofta i låg PCR -känslighet på grund av otillräcklig nukleinsyras frisättning.

Hämning av polymerasaktivitet under amplifiering

I allmänhet används hämning som ett containerkoncept för att beskriva alla faktorer som leder till suboptimala PCR -resultat. I strikt biokemisk mening är hämning begränsad till enzymets aktivitet, dvs. det reducerar eller förhindrar substratproduktomvandling genom interaktion med det aktiva stället för DNA-polymeraset eller dess cofaktor (t.ex. Mg2+ för taq DNA-polymeras).
Komponenter i provet eller olika buffertar och extrakt som innehåller reagens kan direkt hämma enzymet eller fånga dess kofaktorer (t.ex. EDTA), och därigenom inaktivera polymeraset och i sin tur leda till minskade eller falska negativa PCR -resultat.
Många interaktioner mellan reaktionskomponenter och målinnehållande nukleinsyror betecknas emellertid också som "PCR-hämmare". När cellens integritet störs av isolering och nukleinsyran frisätts kan interaktioner mellan provet och dess omgivande lösning och en solid fas uppstå. Till exempel kan "scavengers" binda en eller dubbelsträngat DNA genom icke-kovalenta interaktioner och störa isolering och rening genom att minska antalet mål som så småningom når PCR-reaktionskärlet.
I allmänhet finns PCR -hämmare i de flesta kroppsvätskor och reagens som används för kliniska diagnostiska tester (urea i urin, hemoglobin och heparin i blod), kosttillskott (organiska komponenter, glykogen, fett, Ca2+ joner) och komponenter i miljön (fenoler) , tungmetaller)

Mer rådande PCR-hämmare kan hittas i bakterier och eukaryota celler, icke-mål-DNA, DNA-bindande makromolekyler av vävnadsmatriser och laboratorieutrustning såsom handskar och plast. Rening av nukleinsyror under eller efter extraktion är den föredragna metoden för att avlägsna PCR -hämmare.
Idag kan olika automatiserad extraktionsutrustning ersätta många manuella protokoll, men 100% återhämtning och/eller rening av mål har aldrig uppnåtts. Potentiella hämmare kan fortfarande vara närvarande i de renade nukleinsyrorna eller kan redan ha trätt i kraft. Det finns olika strategier för att minska påverkan av hämmare. Valet av lämpligt polymeras kan ha en betydande inverkan på hämmaraktiviteten. Andra beprövade metoder för att minska PCR -hämning ökar polymeraskoncentrationen eller applicerar tillsatser såsom BSA.
Hämning av PCR -reaktioner kan demonstreras genom användning av intern processkvalitetskontroll (IPC).
Man måste vara försiktig för att ta bort alla reagens och andra lösningar i extraktionssatsen, såsom etanol, EDTA, cetab, LiCl, Guscn, SDS, isopropanol och fenol, från nukleinsyrasolatet genom ett grundligt tvättsteg. Beroende på deras koncentration kan de aktivera eller hämma PCR.