Interferensfaktorer i PCR-reaktioner

Under PCR-reaktionen påträffas ofta vissa störande faktorer.
På grund av PCR:s mycket höga känslighet anses kontaminering vara en av de viktigaste faktorerna som påverkar PCR-resultaten och kan ge falskt positiva resultat.
Lika kritiska är de olika källor som leder till falskt negativa resultat. Om en eller flera viktiga delar av PCR-blandningen eller själva amplifieringsreaktionen hämmas eller störs, kan den diagnostiska analysen försvåras. Detta kan leda till minskad effektivitet och till och med falskt negativa resultat.
Förutom hämning kan förlust av målnukleinsyrans integritet uppstå på grund av transport- och/eller lagringsförhållanden före provberedning. I synnerhet kan höga temperaturer eller otillräcklig lagring leda till skador på celler och nukleinsyror. Cell- och vävnadsfixering och paraffininbäddning är välkända orsaker till DNA-fragmentering och ett ihållande problem (se figur 1 och 2). I dessa fall hjälper inte ens optimal isolering och rening.

Figur 1 | Effekt av immobilisering på DNA-integritet
Agarosgelelektrofores visade att kvaliteten på DNA som isolerats från paraffinsektioner från obduktioner varierade avsevärt. DNA med olika genomsnittliga fragmentlängder fanns i extrakten beroende på fixeringsmetod. DNA bevarades endast när det fixerades i nativa frysta prover och i buffrad neutral formalin. Användningen av ett starkt surt Bouin-fixativ eller obuffrad, myrsyrainnehållande formalin resulterade i en betydande förlust av DNA. Den återstående fraktionen är mycket fragmenterad.
Till vänster uttrycks fragmentens längd i kilobaspar (kbp)

Figur 2 | Förlust av integritet hos nukleinsyramål
(a) Ett 3′-5′ mellanrum på båda strängarna kommer att resultera i ett brott i mål-DNA:t. DNA-syntes kommer fortfarande att ske på det lilla fragmentet. Om ett primerbindningsställe saknas på DNA-fragmentet sker dock endast linjär amplifiering. I det mest gynnsamma fallet kan fragmenten återmätta varandra, men utbytet kommer att vara litet och under detektionsnivåerna.
(b) Förlust av baser, huvudsakligen på grund av depurinering och tymidindimerbildning, leder till en minskning av antalet H-bindningar och en minskning av Tm. Under den förlängda uppvärmningsfasen kommer primrarna att smälta bort från matrix-DNA:t och kommer inte att anneala ens under mindre stränga förhållanden.
(c) Intilliggande tyminbaser bildar en TT-dimer.
Ett annat vanligt problem som ofta uppstår inom molekylärdiagnostik är den mindre optimala frisättningen av målnukleinsyror jämfört med fenol-kloroform-extraktion. I extrema fall kan detta vara förknippat med falskt negativa resultat. Mycket tid kan sparas genom kokande lys eller enzymatisk nedbrytning av cellrester, men denna metod resulterar ofta i låg PCR-känslighet på grund av otillräcklig frisättning av nukleinsyra.

Hämning av polymerasaktivitet under amplifiering

Generellt sett används hämning som ett begrepp för att beskriva alla faktorer som leder till suboptimala PCR-resultat. I strikt biokemisk mening är hämning begränsad till enzymets aktivitet, dvs. den minskar eller förhindrar substrat-produkt-omvandling genom interaktion med DNA-polymerasets aktiva plats eller dess kofaktor (t.ex. Mg2+ för Taq-DNA-polymeras).
Komponenter i provet eller olika buffertar och extrakt som innehåller reagens kan direkt hämma enzymet eller fånga dess kofaktorer (t.ex. EDTA), vilket inaktiverar polymeraset och i sin tur leder till minskade eller falskt negativa PCR-resultat.
Många interaktioner mellan reaktionskomponenter och målinnehållande nukleinsyror betecknas dock också som "PCR-hämmare". När cellens integritet störs genom isolering och nukleinsyran frigörs, kan interaktioner mellan provet och dess omgivande lösning och fasta fas uppstå. Till exempel kan "fångare" binda enkel- eller dubbelsträngat DNA genom icke-kovalenta interaktioner och störa isolering och rening genom att minska antalet mål som så småningom når PCR-reaktionskärlet.
I allmänhet finns PCR-hämmare i de flesta kroppsvätskor och reagens som används för kliniska diagnostiska tester (urea i urin, hemoglobin och heparin i blod), kosttillskott (organiska komponenter, glykogen, fett, Ca2+-joner) och komponenter i miljön (fenoler, tungmetaller).

Mer vanliga PCR-hämmare kan hittas i bakterier och eukaryota celler, icke-mål-DNA, DNA-bindande makromolekyler i vävnadsmatriser och laboratorieutrustning såsom handskar och plast. Rening av nukleinsyror under eller efter extraktion är den föredragna metoden för att avlägsna PCR-hämmare.
Idag kan olika automatiserade extraktionsutrustningar ersätta många manuella protokoll, men 100 % återhämtning och/eller rening av målproteiner har aldrig uppnåtts. Potentiella hämmare kan fortfarande finnas i de renade nukleinsyrorna eller kan redan ha trätt i kraft. Olika strategier finns för att minska hämmarnas inverkan. Valet av lämpligt polymeras kan ha en betydande inverkan på hämmaraktiviteten. Andra beprövade metoder för att minska PCR-hämning är att öka polymeraskoncentrationen eller applicera tillsatser som BSA.
Hämning av PCR-reaktioner kan påvisas med hjälp av intern processkvalitetskontroll (IPC).
Man måste noggrant tvätta nukleinsyraisolaten från alla reagenser och andra lösningar i extraktionskitet, såsom etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol och fenol. Beroende på deras koncentration kan de aktivera eller hämma PCR.