Utförande av fyra nukleinsyraamplifieringsanalyser för att identifiera SARS-CoV-2 i Etiopien

Tack för att du besöker Nature.com. Du använder en webbläsarversion med begränsat CSS-stöd. För bästa upplevelse rekommenderar vi att du använder en uppdaterad webbläsare (eller inaktiverar kompatibilitetsläge i Internet Explorer). Dessutom, för att säkerställa löpande support, visar vi webbplatsen utan stilar och JavaScript.
Visar en karusell med tre bilder samtidigt. Använd knapparna Föregående och Nästa för att gå igenom tre bilder åt gången, eller använd skjutknapparna i slutet för att gå igenom tre bilder åt gången.
Sedan utbrottet av coronavirusets sjukdom (COVID-19) 2019 har många kommersiella nukleinsyraamplifieringstester (NAAT) utvecklats runt om i världen och har blivit standardanalyser. Även om flera tester snabbt utvecklades och tillämpades på laboratoriediagnostiska tester, har prestandan för dessa tester inte utvärderats i en mängd olika miljöer. Därför syftade denna studie till att utvärdera prestandan för Abbott SARS-CoV-2-, Daan Gene-, BGI- och Sansure Biotech-analyser med hjälp av Composite Reference Standard (CRS). Studien genomfördes vid Ethiopian Public Health Institute (EPHI) från 1 till 30 december 2020. 164 nasofaryngeala prover extraherades med QIAamp RNA-minikit och Abbotts DNA-provberedningssystem. Av 164 prover var 59,1 % positiva och 40,9 % negativa för CRS. Sansure Biotechs positivitet var signifikant låg jämfört med CRS (p < 0,05). Sansure Biotechs positivitet var signifikant låg jämfört med CRS (p < 0,05). Положительные результаты Sansure Biotech были значительно ниже по сравнению с CRS (p < 0,05). Sansure Biotechs positiva resultat var betydligt lägre jämfört med CRS (p < 0,05).与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0,05）.与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0,05）. У Sansure Biotech было значительно меньше положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). Sansure Biotech hade signifikant färre positiva resultat jämfört med CRS (p < 0,05).Den övergripande överensstämmelsen mellan de fyra analyserna var 96,3–100 % jämfört med CRS. Förutom den låga positivitetsgraden för Sansure Biotech-analysen var prestandan för de fyra analyserna nästan jämförbar. Som sådan kräver Sansure Biotech [Research Only (RUO)]-analysen ytterligare validering för dess användning i Etiopien. Slutligen bör ytterligare forskning övervägas för att utvärdera analyser med lämpliga tillverkarens påståenden.
Laboratorietester är en del av Världshälsoorganisationens (WHO) strategiska plan för Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) Preparedness and Response (SPRP). WHO rekommenderar att länder måste bygga upp laboratoriekapacitet för att förbättra beredskapen, korrekt ärendehantering, vaksamhet och snabba svar på folkhälsoutmaningar. Detta tyder på att laboratoriets roll är nyckeln till att karakterisera sjukdomen och epidemiologin hos nya smittämnen och kontrollera deras spridning.
Diagnosen covid-19 kräver epidemiologisk och medicinsk information, personliga symtom/tecken och röntgen- och laboratoriedata2. Sedan covid-19-utbrottet rapporterades i Wuhan, Kina, har många kommersiella nukleinsyraförstärkningstester (NAAT) utvecklats runt om i världen. Realtids omvänd transkriptionspolymeraskedjereaktion (rRT-PCR) har använts som en rutin och standardmetod för laboratoriediagnostik av allvarlig akut respiratorisk syndrom 2 (SARS-CoV-2)3-infektion. Molekylär detektion av SARS-CoV-2 är vanligtvis baserad på generna N (nukleokapsidproteingen), E (höljeproteingen) och RdRp (RNA-beroende RNA-polymerasgen) i ORF1a/b (öppen läsram 1a/b) . gen) region identifierad från det virala genomet. De anses vara de huvudsakliga konserverade regionerna som finns i virala genom för virusigenkänning4. Bland dessa gener har RdRp- och E-generna hög analytisk detektionskänslighet, medan N-genen har låg analytisk känslighet5.
Prestandan för PCR-analyser kan variera beroende på olika faktorer såsom: extraktionsreagenser, amplifierings-/detektionsreagenser, extraktionsmetod, PCR-maskinens kvalitet och andra instrument. Från och med april 2020 har mer än 48 olika diagnostiska enheter från nio länder erhållit Emergency Use Authorization (EUA) för diagnostik av covid-196. I Etiopien används mer än 14 realtids-PCR-plattformar för PCR-detektering av SARS-CoV-2 vid 26 folkhälsoinstitutioner, inklusive ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 och Quant-studio7. Dessutom finns olika PCR-testkit tillgängliga, såsom Daan-gentest, Abbott SARS-CoV-2-test, Sansure Biotech-test och SARS-CoV-2 BGI-test. Även om rRT-PCR är mycket känslig, rapporterar vissa patienter med COVID-19 falskt negativa resultat på grund av otillräckliga kopior av viral ribonukleinsyra (RNA) i prover på grund av felaktig insamling, transport, förvaring och hantering samt laboratorietester. personalens villkor och handlingar8. Dessutom kan felaktig hantering av prov eller kontroll, inställning av cykeltröskel (Ct) och korsreaktivitet med andra patogena nukleinsyror eller inaktivt/resterande SARS-CoV-2-RNA leda till falskt positiva resultat i rRT-PCR9-analyser. Således är det tydligt att PCR-tester verkligen kan identifiera bärare av genfragment, eftersom de inte ens kan skilja mellan verkligt aktiva virala gener, så testerna kan bara identifiera bärare och inte patienter10. Därför är det viktigt att bedöma diagnostisk prestanda med standardmetoder i vår miljö. Även om många NAAT-reagens finns tillgängliga på Ethiopian Public Health Institute (EPHI) och i hela landet, har ingen jämförande utvärdering av deras effektivitet ännu rapporterats. Därför syftade denna studie till att utvärdera den jämförande prestandan hos kommersiellt tillgängliga kit för detektering av SARS-CoV-2 genom rRT-PCR med hjälp av kliniska prover.
Totalt 164 deltagare med misstänkt covid-19 inkluderades i denna studie. Majoriteten av proverna var från behandlingscentra (118/164 = 72 %), medan de återstående 46 (28 %) deltagarna var från icke-behandlingscentra. Bland deltagare som inte behandlades på centret hade 15 (9,1%) kliniskt misstänkta fall och 31 (18,9%) hade kontakter med bekräftade fall. Nittiotre (56,7 %) deltagare var män och deltagarnas medelålder (± SD) var 31,10 (± 11,82) år.
I denna studie bestämdes positiva och negativa frekvenser av fyra tester för covid-19. Således var de positiva frekvenserna för Abbott SARS-CoV-2-analysen, Daan Gene 2019-nCoV-analysen, SARS-CoV-2 BGI-analysen och Sansure Biotech 2019-nCoV-analysen 59,1 %, 58,5 %, 57,9 % respektive 55,5 % . De positiva och negativa resultaten för sammansatt referensstandard (CRS) var 97 (59,1 %) respektive 67 (40,9 %) (tabell 1). I denna studie baserades definitionen av CRS på regeln "alla positiva", varvid av fyra testresultat, två eller flera testresultat som gav samma resultat ansågs vara verkligt positiva eller negativa.
I denna studie fann vi en negativ procentuell överenskommelse (NPA) på 100 % (95 % CI 94,6–100) för alla analyser jämfört med CRS. Sansure Biotechnology-analysen visade en minimal PPA på 93,8 % (95 % CI 87,2-97,1) och Daan Gene 2019-nCoV-analysen hade en överensstämmelse på 99,4 % (95 % CI 96,6-99,9). Däremot var den totala överensstämmelsen mellan SARS-CoV-2 BGI-analysen och Sansure Biotech 2019-nCoV-analysen 98,8 % respektive 96,3 % (tabell 2).
Cohens kappa-koefficient för överensstämmelse mellan CRS och Abbotts SARS-CoV-2-analysresultat var helt konsekvent (K = 1,00). På liknande sätt är Cohens kappa-värden detekterade av Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI och Sansure Biotech 2019-nCoV också helt förenliga med CRS (K ≥ 0,925). I denna jämförande analys visade chi-kvadrattestet (McNemar-testet) att resultaten från Sansure Biotech 2019-nCoV-analysen skilde sig signifikant från CRS-resultaten (p = 0,031) (tabell 2).
Som visas i fig.1 procentandelen lägsta Ct-värde (< 20 Ct) i Abbott SARS-CoV-2-analysen (kombinerad RdRp- och N-gen) var 87,6 % och ORF1a/b-genens Ct-värde för Sansure Biotech 2019-nCoV-analysen visade att andelen låga Ct-värdet (< 20 Ct) var 50,3 % och det höga Ct-värdet (36–40) Ct) var 3,2 %. 1 procentandelen lägsta Ct-värde (< 20 Ct) i Abbott SARS-CoV-2-analysen (kombinerad RdRp- och N-gen) var 87,6 % och ORF1a/b-genens Ct-värde för Sansure Biotech 2019-nCoV-analysen visade att andelen låga Ct-värdet (< 20 Ct) var 50,3 % och det höga Ct-värdet (36–40) Ct) var 3,2 %.Som visas i fig.1, процент наименьшего значения Ct (< 20 Ct) анализа Abbott SARS-CoV-2 (комбинированный ген RdRp и N) составил 87,6 Ct Ot 87,6%, г. анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показало что процент низкого значения Ct (< 20 Ct) составлял 50,3 %, а высокое значения (36 Ct)–4 Ctначения составляло 3,2%. 1, procentandelen av den lägsta Ct-värdet (< 20 Ct) analysen av Abbott SARS-CoV-2 (kombinerad gen RdRp och N) var 87,6 %, och Ct-värdet för ORF1a/b genanalys av Sansure Biotech 2019-nCoV visade att andelen lågt Ct-värde (< 20 Ct) stod för 50,3 % och högt värde Ct (36–40 Ct) stod för 3,2 %.如图1 所示，Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp 和N 基因）的最低Ct 值百分比三（（< 20% Ct. 2019-nCoV 检测的ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 的百分比为50,3%，高Ct 值Ct(36)的百分比为3,2 %. Som visas i figur 1 är den lägsta procentandelen Ct-värde (< 20 Ct) för Abbott SARS-CoV-2-test (kombination av RdRp- och N-gen) 87,6 %, ORF1a/b-genens Ct-värde för Sansure Biotech 2019-nCoV-testet visar låg Ct值(< 20 Ct) 的 procent är 50,3 %,高Ct 值(36–40 Ct) 的 procent är 3,2 %. Hur kan jag hitta рисунке 1, анализ Abbott SARS-CoV-2 (сочетающий гены RdRp и N) имел самое низкое процентное процентное (2 Ctчентное () размере 87,6%, а значение Ct гена ORF1a/b в исследовании Sansure Biotech 2019- Анализ nCoV показал низкий Ct. Som visas i figur 1 hade Abbott SARS-CoV-2-analysen (som kombinerar RdRp- och N-generna) det lägsta procentuella Ct-värdet (< 20 Ct) vid 87,6 %, medan Ct-värdet för ORF1a/b-genen i Sansure Biotech 2019 studie – Analysen av nCoV visade ett lågt Ct. Процент значений (< 20 Ct) составил 50,3%, en процент высоких значений Ct (36–40 Ct) составил 3,2%. Andelen värden (< 20 Ct) var 50,3 % och andelen höga Ct-värden (36–40 Ct) var 3,2 %.Abbott SARS-CoV-2 B-testet registrerade Ct-värden över 30. Å andra sidan, på BGI SARS-CoV-2-analysen hade ORF1a/b-genen ett högt Ct-värde (> 36 Ct) procentandelen var 4% (Fig. 1). Å andra sidan, på BGI SARS-CoV-2-analysen hade ORF1a/b-genen ett högt Ct-värde (> 36 Ct) procentandelen var 4% (Fig. 1). Сдругой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 ген ORF1a/b имел высокое значение Ct (> 36 Ct), процент которого состали 1 (рисокое значение). Å andra sidan, i analysen av BGI SARS-CoV-2-genen hade ORF1a/b ett högt Ct-värde (> 36 Ct), vars procentandel var 4% (Fig. 1).另一方面，在BGI SARS-CoV-2 检测中，ORF1a/b 基因具有高Ct 值（> 36 Ct）的百分毼为分毼为分比为 Å andra sidan, vid BGI SARS-CoV-2-detektion är andelen ORF1a/b-gen med högt Ct-värde (>36 Ct) 4% (Figur 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 процент генов ORF1a/b с высокими значениями Ct (>36 Ct) составил 4% (рис.). Å andra sidan, i BGI SARS-CoV-2-analysen, var andelen ORF1a/b-gener med höga Ct-värden (>36 Ct) 4 % (Fig. 1).
I denna studie tog vi 164 nasofaryngeala prover. För alla typer av analyser utfördes RNA-isolering och amplifiering med de metoder och kit som rekommenderas av respektive tillverkare.
Denna studie visade att Abbotts test för SARS-CoV-2 har samma detektionsprestanda som CRS, med 100 % positiv, negativ och övergripande överensstämmelse. Cohens kappa-avtal är 1.00, vilket indikerar full överenskommelse med CRS. En liknande studie från University of Washington i USA visade att den övergripande känsligheten och specificiteten för Abbott-testet för SARS-CoV-2 var 93 % respektive 100 % jämfört med den laboratoriebestämda analysen (LDA) av CDC . 11. Abbotts SARS-CoV-2-detektionssystem är baserat på samtidig kombinerad detektering av N- och RdRp-gener, eftersom båda generna är känsligare, vilket minimerar falska negativa effekter12. En studie i Wien, Österrike visade också att stora extraktionsprovvolymer och detektionseluentvolymer minimerade utspädningseffekterna och ökade detektionseffektiviteten13. Således kan Abbotts perfekta matchning för SARS-CoV-2-analysen associeras med ett plattformsdetektionssystem som samtidigt detekterar kombinatoriska gener, extraherar ett stort antal prover (0,5 ml) och använder en stor mängd eluent (40 µl).
Våra resultat visade också att detektionsprestandan för Daan genetiska test var nästan densamma som för CRS. Detta överensstämmer med en studie14 som genomfördes vid Anhui University i Huainan, Kina, och tillverkarens påstående om 100 % positiv överenskommelse. Trots rapporter om konsekventa resultat var ett prov falsknegativt efter omtestning av samma eluat, men var positivt i Abbott SARS-CoV-2 och Sansure Biotech nCoV-2019 analyser. Detta tyder på att det kan finnas variationer i resultat mellan olika typer av analyser. Icke desto mindre, i studien som utfördes i Kina15, var resultatet av Daan Gene-analysen signifikant annorlunda (p < 0,05) jämfört med deras laboratoriedefinierade referensanalys. Icke desto mindre, i studien som utfördes i Kina15, var resultatet av Daan Gene-analysen signifikant annorlunda (p < 0,05) jämfört med deras laboratoriedefinierade referensanalys. Тем не менее, в исследовании, проведенном в Китае15, результат анализа Daan Gene значительно отличался отличался (p < 0,05) эталонного анализа. Men i en studie i Kina15 skilde sig Daan Genes analysresultat signifikant (p < 0,05) från deras laboratoriereferensanalys.然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（p < 0,05）.然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результаты генетического теста Daan значительно отличались в Китае15 (p < 0,05) его эталонным лабораторным тестом. Men i en studie i Kina15 var resultaten av Daans genetiska test signifikant annorlunda (p < 0,05) jämfört med dess referenslaboratorietest.Denna avvikelse kan bero på referenstestets känslighet för att detektera SARS-CoV-2, och ytterligare studier kan vara viktiga för att fastställa orsaken.
Dessutom utvärderade vår studie den jämförande prestandan för SARS-CoV-2 BGI-analysen med CRS, som visade utmärkt positiv procentuell överensstämmelse (PPA = 97,9%), negativ procentuell överensstämmelse (NPA = 100%) och övergripande procentuell överensstämmelse per kön ( OPA). ). = 98,8 %). Cohens Kappa-värden visade god överensstämmelse (K = 0,975). Studier i Nederländerna16 och Kina15 har visat konsekventa resultat. SARS-CoV-2 BGI-testet är ett enstaka gen (ORF1a/b) detektionstest med användning av 10 µl amplifierings-/detektionseluat. Trots god statistisk överensstämmelse med våra referensresultat, missade analysen två positiva prov (1,22 %) av det totala provet. Detta kan ha enorma kliniska konsekvenser för överföringsdynamiken på både patient- och samhällsnivå.
En annan jämförande analys som ingick i denna studie var Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR (RUO) analys; den totala matchningsprocenten var 96,3 %. Överenskommelsens styrka bestämdes också av Cohens Kappa-värde, som var 0,925, vilket indikerar full överensstämmelse med CRS. Återigen är våra resultat identiska med studier som utfördes vid Central South University i Changsha, Kina, och vid den kliniska laboratorieavdelningen på Liuzhou People's Hospital, Liuzhou City, Kina17. Även om ovanstående goda statistiska överensstämmelse registrerades, visade chi-kvadrattestet (MacNemar-testet) att resultatet av Sansure Biotech-analysen har haft en statistiskt signifikant skillnad jämfört med CRS (p < 0,005). Även om ovanstående goda statistiska överensstämmelse registrerades, visade chi-kvadrattestet (MacNemar-testet) att resultatet av Sansure Biotech-analysen har haft en statistiskt signifikant skillnad jämfört med CRS (p < 0,005). Несмотря на то, что было зафиксировано указанное выше хорошее статистическое соответствие, критеритерикхий Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имеет статистически значимое различие på сравнению с CRS (p. 5 <). Även om den goda statistiska överensstämmelsen ovan registrerades, visade chi-kvadrattestet (McNemar-testet) att resultatet av Sansure Biotech-analysen hade en statistiskt signifikant skillnad jämfört med CRS (p < 0,005).尽管记录了上述良好的统计一致性，但卡方检验（MacNemar 检验）桨明，Sansure 明，Sansure 看県相比具有统计学显着差异（p < 0,005）.尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 检验 （（macnemar 检验 桨明 , san biotech ，与 crs 相比 具有 显着 （(p <0,005。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。… Несмотря на отмеченное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макрамакне) статистически значимую разницу (p < 0,005) между анализом Sansure Biotech och CRS. Trots den goda statistiska överensstämmelsen som noterats ovan visade chi-kvadrattestet (McNemar-testet) en statistiskt signifikant skillnad (p < 0,005) mellan Sansure Biotech-analysen och CRS.Sex prover (3,66 %) visade sig vara falskt negativa jämfört med CRS (kompletterande tabell 1); detta är mycket viktigt, särskilt med tanke på dynamiken i överföringen av viruset. Ovanstående data stöder också denna låga upptäcktsfrekvens15.
I denna studie bestämdes Ct-värden för varje analys och respektive plattform, med det lägsta genomsnittliga Ct-värdet rapporterat i Abbott SARS-CoV-2-analysen. Detta resultat kan vara relaterat till Abbotts simultana kombinerade genetiska testsystem för detektering av SARS-CoV-2. Därför, enligt figur 1, hade 87,6 % av Abbott SARS-CoV-2-resultaten Ct-värden under 20. Endast ett litet antal provresultat (12,4 %) var i intervallet 20-30. Ct-värden över 30 registrerades inte. Utöver Abbotts användning av SARS-CoV-2-panelens genetiska testformat, kan detta resultat vara relaterat till den nedre detektionsgränsen (32,5 RNA-kopior/ml)18, vilket är tre gånger lägre än företagets nedre gräns på 100 RNA-kopior /ml. ml)19.
Denna studie har vissa begränsningar: för det första har vi inte standard-/referensmetoder [som virusmängd eller andra laboratorietester (LDA)] på grund av brist på resurser. För det andra var alla prover som användes i denna studie nasofaryngeala pinnprover, medan resultaten inte var tillämpliga på andra provtyper, och för det tredje var provstorleken liten.
Denna studie jämförde prestandan för fyra rRT-PCR-analyser för SARS-CoV-2 med nasofaryngeala prover. Alla detektionsanalyser hade nästan jämförbara prestanda, med undantag för Sansure Biotech-analysen. Dessutom identifierades den låga positivitetsgraden i Sansure Biotech-analysen jämfört med CRS (p < 0,05). Dessutom identifierades den låga positivitetsgraden i Sansure Biotech-analysen jämfört med CRS (p < 0,05). Кроме того, в тесте Sansure Biotech был выявлен низкий процент положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). Dessutom visade Sansure Biotech-testet en låg andel positiva resultat jämfört med CRS (p < 0,05).此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0,05)。此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0,05)。 Кроме того, анализ Sansure Biotech имел более низкий уровень положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). Dessutom hade Sansure Biotech-analysen en lägre positivitet jämfört med CRS (p < 0,05).Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO)-analysen av PPA, NPA och övergripande överenskommelse översteg 93,5 % med ett Cohen Kappa-överensstämmelsevärde på 0,925. Slutligen behöver Sansure Biotech Assay (RUO) ytterligare validering för användning i Etiopien, och ytterligare forskning bör övervägas för att utvärdera påståenden från enskilda tillverkare.
Jämförande studiedesign utfördes vid fyra hälsoinrättningar i Addis Abeba, Eka Kotebe Hospital, Millennium Church Treatment Centre, Zewooditu Memorial Hospital och St. Peter's Tuberculosis Specialist Hospital. Uppgifterna samlades in mellan 1 och 31 december 2020. De medicinska faciliteterna för denna studie valdes målmedvetet ut utifrån deras höga antal fall och tillgången på större behandlingscenter i staden. På liknande sätt valdes instrument, inklusive ABI 7500 och Abbott m2000 realtids-PCR-instrument, enligt rekommendationer från NAAT-reagenstillverkare, och fyra PCR-detektionskit valdes ut för denna studie, eftersom de flesta laboratorier i Etiopien använde minst minst fyra av dem. Gentest, Abbott SARS-CoV-2-test, Sansure Biotech-test och SARS-CoV-2 BGI-test utfört under studien).
Testning för SARS-CoV-2 utfördes från 1 till 30 december 2020 med 3 ml Viral Transport Medium (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, Kina) från individer som undersökts för covid-19 hänvisade till EPHI. Nasofaryngeala prover samlades in av utbildade provsamlare och skickades till EPHI i trippelförpackningar. Före nukleinsyraisolering tilldelas varje prov ett unikt identifikationsnummer. Extraktion utförs från varje prov omedelbart efter ankomst med manuella och automatiska extraktionsmetoder. För automatisk extraktion av Abbott m2000 extraherades således 1,3 ml (inklusive 0,8 ml dödvolym och 0,5 ml extraktionsinloppsvolym) av provet från varje prov och passerade genom Abbott DNA Sample Preparation System (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, USA). ) En sats på 96 [92 prover, två detektionskontroller och två icke-mallkontroller (NTC)] inkluderades i den övergripande processen (hämtning och detektion) av två omgångar av SARS-CoV-2 (EUA) i realtid. brytning. På samma sätt, för manuell extraktion, använd samma prover (för automatisk extraktion och upptäckt). Under hela processen alikvoterades 140 µl prover och extraherades med QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Tyskland) i satser om 24 (inklusive 20 prover, två analyskontroller och två NTC) under nio omgångar. Manuellt extraherade eluat amplifierades och detekterades med en ABI 7500 termisk cykler med SARS-CoV-2 BGI-analys, Daan Gene-analys och Sansure Biotech-analys.
Automatiserad isolering och rening av SARS-CoV-2 viralt RNA följer principen om magnetiska pärlor med hjälp av Abbott DNA-provberedningsreagenser. Inaktivering av prover och solubilisering av virala partiklar utförs med användning av en detergent innehållande guanidin isotiocyanat för att denaturera proteinet och inaktivera RNas. RNA:t separeras sedan från proteinet genom fastfasseparation med kiseldioxid, dvs guanidiniumsaltet och lysbuffertens alkaliska pH främjar bindningen av nukleinsyrorna till kiseldioxiden (SiO2). Sköljningssteget tar bort kvarvarande proteiner och skräp för att producera en klar lösning. Transparent RNA isoleras från kiseldioxidbaserade mikropartiklar med hjälp av instrumentets magnetfält20,21. Å andra sidan utförs manuell isolering och rening av RNA med spinkolonnmetoden med användning av centrifugering istället för ett magnetiskt stativ och separation av mikropartiklar från eluenten.
Abbott Real-Time SARS-CoV-2 Detection Test (Abbott Molecular, Inc.) utfördes enligt tillverkarens instruktioner, som fick EUA19,22 från WHO och FDA. I detta protokoll utfördes provinaktivering före extraktion i ett vattenbad vid 56 ° C i 30 minuter. Efter virusinaktivering utfördes nukleinsyraextraktion på ett Abbott m2000 SP-instrument från 0,5 ml VTM med användning av ett Abbott m2000 DNA-provberedningssystem. enligt tillverkaren. Amplifiering och detektion utfördes med användning av ett Abbott m2000 RT-PCR-instrument, och dubbeldetektion utfördes för RdRp- och N-generna. ROX) och VIC P (proprietärt färgämne) för inriktning och detektering av interna kontroller, vilket möjliggör samtidig detektering av båda amplifieringsprodukterna 19 .
Amplifieringsdetektionsmetoden för detta kit är baserad på enstegs RT-PCR-teknologi. ORF1a/b- och N-generna valdes ut som konserverade regioner av Daan Gene Technology för att detektera målregionamplifiering. Specifika primrar och fluorescerande prober (N-gensonder märkta med FAM, ORF1a/b-prober märkta med VIC) har designats för att detektera SARS-CoV-2-RNA i prover. Den slutliga eluenten och masterblandningarna bereddes genom att tillsätta 5 µl eluent till 20 µl av mastermixen till en slutlig volym av 25 µl. Amplifiering och detektion utfördes samtidigt på ett ABI 750024 realtids-PCR-instrument.
ORF1a/b- och N-generna detekterades med Sansure Biotech nCoV-2019 Nucleic Acid Diagnostic Kit (fluorescerande PCR-detektion). Förbered specifika prober för varje målgen genom att välja FAM-kanalen för ORF1a/b-regionen och ROX-kanalen för N-genen. Till detta analyskit tillsätts eluent och mastermixreagens enligt följande: förbered 30 µl mastermix-reagens och 20 µl eluerat prov för detektion/amplifiering. Realtids-PCR ABI 750025 användes för amplifiering/detektion.
SARS-CoV-2 BGI-testet är ett fluorescerande rRT-PCR-kit i realtid för diagnos av covid-19. Målregionen är belägen i ORF1a/b-regionen av SARS-CoV-2-genomet, vilket är en metod för att detektera en enda gen. Dessutom är den humana hushållsgenen β-aktin en internt reglerad målgen. Mastermixen bereds genom att blanda 20 µl av mastermix-reagenset och 10 µl av det extraherade RNA-provet i en brunnsplatta26. Ett ABI 7500 fluorescerande kvantitativt realtids-PCR-instrument användes för amplifiering och detektion. All nukleinsyraamplifiering, PCR-körningsbetingelser för varje analys och tolkning av resultat utfördes enligt respektive tillverkarens instruktioner (tabell 3).
I denna jämförande analys använde vi inte referensstandardmetoden för att bestämma procentuell överensstämmelse (positiv, negativ och övergripande) och andra jämförelseparametrar för de fyra analyserna. Varje testjämförelse gjordes med CRS, i denna studie sattes CRS av regeln "alla positiva" och resultatet bestämdes, inte av ett enda test, vi använde minst två matchade testresultat. Dessutom, vid överföring av covid-19, är falska negativa resultat farligare än falskt positiva resultat. Därför, för att säga "positivt" så exakt som möjligt från ett CRS-resultat, måste minst två analystester vara positiva, vilket innebär att minst ett positivt resultat sannolikt kommer från en EUA-analys. Av fyra testresultat anses alltså två eller flera testresultat som ger samma resultat vara verkligt positiva eller negativa18,27.
Data samlades in med hjälp av strukturerade dataextraktionsformulär, datainmatning och analys utfördes med hjälp av Excel statistisk programvara och SPSS version 23.0 för beskrivande statistik. Positiv, negativ och total procentuell överensstämmelse analyserades och en Kappa-poäng användes för att bestämma graden av överensstämmelse för varje metod med CRS. Kappa-värden tolkas enligt följande: 0,01 till 0,20 för mild överensstämmelse, 0,21 till 0,40 för allmän överenskommelse, 0,41-0,60 för måttlig överenskommelse, 0,61-0,80 för större överensstämmelse och 0,81-0,99 för fullständig överensstämmelse28.
Etiskt tillstånd erhölls från University of Addis Abeba och alla experimentella protokoll för denna studie godkändes av Ethiopian Public Health Institutes Scientific Ethics Review Board. Referensnumret för EPHI Ethics License är EPHI/IRB-279-2020. Alla metoder tillämpades i enlighet med rekommendationerna och bestämmelserna i de etiopiska nationella övergripande riktlinjerna för behandling av covid-19. Dessutom erhölls skriftligt informerat samtycke från alla studiedeltagare innan deltagandet i studien.
All data som erhållits eller analyserats i denna studie ingår i denna publicerade artikel. Data som stöder resultaten av denna studie är tillgängliga från respektive författare på rimlig begäran.
Världshälsoorganisationen. Rekommendationer för laboratorieteststrategier för covid-19: Interimsvägledning, 21 mars 2020 nr. WHO/2019-nCoV/lab_testing/2020.1 (WHO, 2020).
Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, KI Covid-19 smart diagnos på akutmottagningen: All-in i praktiken. Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, KI Covid-19 smart diagnos på akutmottagningen: All-in i praktiken.Muliou, DS, Pantazopoulos, I. och Gurgulianis, KI Intelligent diagnos av covid-19 på akutmottagningen: allt i praktiken.Muliou DS, Pantazopoulos I. och Gurgulyanis KI Intelligent diagnos av COVID-19 på akutmottagningar: end-to-end integration i praktiken. Expert pastor Respire. medicin. 3, 263–272 (2022).
Mitchell, SL & St George, K. Utvärdering av COVID19 ID NOW EUA-analysen. Mitchell, SL & St George, K. Utvärdering av COVID19 ID NOW EUA-analysen.Mitchell, SL och St. George, K. Utvärdering av COVID19 ID NOW EUA-analysen.Mitchell SL och St. George K. Utvärdering av COVID19 ID NOW EUA-analysen. J. Clinical. Virus. 128, 104429. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104429 (2020).
WHO. Laboratoriedetektering av coronavirus sjukdom 2019 (COVID-19) vid misstänkt mänsklig sjukdom. https://www.who.int/publications/i/item/10665-331501 (tillgänglig 15 augusti 2020) (WHO, 2020).
Udugama, B. et al. COVID-19-diagnos: Sjukdomar och testverktyg. ACS Nano 14(4), 3822–3835 (2020).
Syed S. et al. Etablering av College of Pathologists of Eastern, Central and Southern Africa – Regional School of Pathology of the Middle East and South Africa. Afrika. J. Lab. medicin. 9(1), 1–8 (2020).
Etiopiska folkhälsoinstitutet, Federala hälsoministeriet. Interimistisk nationell strategi och vägledning för laboratoriediagnos av covid-19. https://ephi.gov.et/images/novel_coronavirus/EPHI_PHEOC_COVID-19_Laboratory_Diagnosis_Eng.pdf (tillgänglig 12 augusti 2020) (EPHI, 2020).
Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, AS Falskt negativa tester för SARS-CoV-2-infektionsutmaningar och implikationer. Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, AS Falskt negativa tester för SARS-CoV-2-infektionsutmaningar och implikationer.Voloshin S., Patel N. och Kesselheim AS Falsknegativa tester för SARS-CoV-2-infektioner och deras konsekvenser.Voloshin S., Patel N. och Kesselheim AS Falskt negativa tester för provokation och påverkan av SARS-CoV-2-infektion. N. eng. J. Medicin. 383(6), e38 (2020).
Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Falskt positiva och falskt negativa covid-19-fall: Andningsförebyggande och hanteringsstrategier, vaccination och ytterligare perspektiv. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Falskt positiva och falskt negativa covid-19-fall: Andningsförebyggande och hanteringsstrategier, vaccination och ytterligare perspektiv. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI. вакцинация и дальнейшие перспективы. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Falskt positiva och falskt negativa fall av covid-19: andningsprevention och behandlingsstrategier, vaccination och vägen framåt.Muliu, DS och Gurgulianis, KI Falskt positiva och falsknegativa fall av COVID-19: strategier för andningsprevention och behandling, vaccination och vägen framåt. Expert pastor Respire. medicin. 15(8), 993–1002 (2021).
Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. COVID-19-diagnos på akutmottagningen: Ser trädet men förlorar skogen. Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. COVID-19-diagnos på akutmottagningen: Ser trädet men förlorar skogen.Mouliou, DS, Ioannis, P. och Konstantinos, G. COVID-19 Diagnos på akutmottagningen: Se trädet, förlora skogen.Muliou DS, Ioannis P. och Konstantinos G. COVID-19 Diagnos i akutmottagningar: Inte tillräckligt med skog för träden. Synas. medicin. J. https://doi.org/10.1136/emermed-2021-212219 (2022).
Degli-Angeli, E. et al. Validering och validering av den analytiska och kliniska prestandan för Abbott RealTime SARS-CoV-2-analysen. J. Clinical. Virus. 129, 104474. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104474 (2020).
Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Jämförelse av fem primeruppsättningar från olika genomregioner av COVID-19 för detektion av virusinfektion med konventionell RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Jämförelse av fem primeruppsättningar från olika genomregioner av COVID-19 för detektion av virusinfektion med konventionell RT-PCR.Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. och Aflatunyan, B. Jämförelse av fem uppsättningar primers från olika regioner av COVID-19-genomet för detektion av virusinfektion med konventionell RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. 比较来自COVID-19不同基因组区域的五个引物组，用于通过常规RT-PCR 检测病毒感染。 Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Jämförelse av 5 olika genetiska regioner av COVID-19 för detektion av virusinfektion med konventionell RT-PCR.Mollaei HR, Afshar AA, Kalantar-Neyestanaki D, Fazlalipour M. och Aflatunyan B. Jämförelse av fem uppsättningar primers från olika regioner av COVID-19-genomet för detektion av virusinfektion med konventionell RT-PCR.Iran. J. Microbiology. 12(3), 185 (2020).
Goertzer, I. et al. Preliminära resultat av det nationella externa kvalitetsbedömningsprogrammet för detektion av SARS-CoV-2-genomsekvenser. J. Clinical. Virus. 129, 104537. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104537 (2020).
Wang, M. et al. Analytisk utvärdering av effektiviteten av fem RT-PCR-kit för allvarligt akut respiratoriskt syndrom Coronavirus 2. J. Clinical. laboratorium. anus. 35(1), e23643 (2021).
Wang B. et al. Utvärdering av sju kommersiellt tillgängliga SARS-CoV-2 RNA-detektionskit i Kina baserade på realtidspolymeraskedjereaktion (PCR). klinisk. Kemisk. laboratorium. medicin. 58(9), e149–e153 (2020).
van Casteren, PB et al. Jämförelse av sju kommersiella RT-PCR COVID-19 diagnostiska kit. J. Clinical. Virus. 128, 104412 (2020).
Lu, Yu, et al. Jämförelse av diagnostisk prestanda för två PCR-kit för detektion av SARS-CoV-2-nukleinsyror. J. Clinical. laboratorium. anus. 34(10), e23554 (2020).
Lefart, PR, etc. En jämförande studie av fyra SARS-CoV-2 nukleinsyraamplifieringstestplattformar (NAAT) visade att ID NOW-prestandan var signifikant försämrad beroende på patient och provtyp. diagnos. mikrobiologi. Infektera. diss. 99(1), 115200 (2021).
Abbott molekyl. Abbotts bipacksedel för SARS-CoV-2-analys i realtid. https://www.molecular.abbott/us/en/products/infectious-disease/RealTime-SARS-CoV-2-Assay. 1-12. (Från och med 10 augusti 2020) (2020).
Klein, S. et al. SARS-CoV-2 RNA-isolering med hjälp av magnetiska pärlor för snabb storskalig detektion med RT-qPCR och RT-LAMP. Virus 12(8), 863 (2020).